37. pants

Saskaņā ar Guthrie et al. (2013) daži pamatsoļi, ko

var mainīt atkarībā no vietējām (gadījumam specifiskām) prasībām,

izmantotajiem testēšanas komplektiem un pieejamā aprīkojuma:

37.1. praimeru un zondes sekvences AHSV sugas vīrusu

noteikšanai:

37.1.1. tiešais praimeris -

5′-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA-GCC-T-3′;

37.1.2. atgriezeniskais praimeris -

5′-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA-TGA-3′;

37.1.3. MGB-TaqMan zonde -

5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′;

37.2. praimera un zondes maisījuma atšķaidījumus pagatavo 25 ×

koncentrācijā 5 μΜ attiecībā uz tiešo un atgriezenisko praimeri

un 3 μΜ attiecībā uz zondi. Jāsagatavo testa plates izkārtojums

un jāieraksta reāllaika PCR mašīnas programmatūrā.

Izmantojot izkārtojumu par norādi, μl paraugu RNS, tostarp testa

paraugus un pozitīvās un negatīvās kontroles, pievieno

attiecīgajās plates iedobēs, kā paredzēts norādē;

37.3. RNS denaturē, karsējot 5 minūtes 95 °C temperatūrā, un

pēc tam vismaz 3 minūtes ātri atdzesē uz ledus;

37.4. sagatavo attiecīgu daudzumu viensoļa reāllaika RT-PCR

reaģentu maisījuma atbilstoši analizējamo paraugu skaitam pēc

ražotāja norādījumiem. 1 μl no 25 × praimera un zondes maisījuma

atšķaidījuma (37.2. apakšpunkts) iekļauj reaģentu maisījumā, lai

katrā iedobē iegūtu galīgo koncentrāciju 200 nM attiecībā uz

katru praimeri un 120 nM zondes. 20 μl reaģentu maisījuma sadala

katrā iedobē uz PCR plates, kas satur denaturēto RNS;

37.5. plati ievieto reāllaikā amplifikatorā, kas ieprogrammēts

atgriezeniskās transkripcijas un cDNS

amplifikācijas/fluorescences noteikšanai atbilstoši ražotāja

norādēm. Amplifikācijas apstākļi ietver, piemēram, pirmo

atgriezeniskās transkripcijas soli 10 minūšu 48 °C temperatūrā un

tad 10 minūšu 95 °C temperatūrā, un 40 ciklu pa 15 sekundēm 95 °C

temperatūrā, un 45 sekundes 60 °C temperatūrā;

37.6. paraugi ir uzskatāmi par pozitīviem, ja AHSV RT-PCR

analīzes normalizēta fluorescence pārsniedz 0,1 slieksni 36 PCR

ciklos visos parauga atkārtojumos.