500. pants

Paraugu paskābina, pievienojot sērskābi, un pēc tam

suspendē etanola un ūdens maisījumā. Maisījumu viegli karsē, lai

izkausētu lipīdu fāzi un veicinātu kvantitatīvu ekstrakciju, pēc

tam maisījumu izfiltrē. Konservantus filtrātā nosaka apgrieztas

fāzes HPLC, par iekšējo standartu izmantojot

izopropil-4-hidroksibenzoātu.

501. 2-Fenoksietanola, 1-fenoksipropān-2-ola, metil-, etil-,

propil-, butil- un benzil-4-hidroksibenzoāta noteikšanas metodei

izmanto šādus reaģentus1, 2, 3:

501.1. Absolūtais etanols.

501.2. 2-fenoksietanols.

501.3. 1-fenoksipropān-2-ols.

501.4. Metil-4-hidroksibenzoāts (metilparabens).

501.5. Etil-4-hidroksibenzoāts (etilparabens).

501.6. n-propil-4-hidroksibenzoāts (propilparabens).

501.7. Izopropil-4-hidroksibenzoāts (izopropilparabens).

501.8. n-butil-4-hidroksibenzoāts (butilparabens).

501.9. Benzil-4-hidroksibenzoāts (benzilparabens).

501.10. Tetrahidrofurāns.

501.11. Metanols.

501.12. Acetonitrils.

501.13. Sērskābes šķīdums, c(H2SO4) = 2

mol/l.

501.14. Etanola/ūdens maisījums: sajauc deviņas tilpuma

vienības etanola un vienu tilpuma vienību ūdens.

501.15. Iekšējā standarta šķīdums: precīzi nosver aptuveni

0,25 g izopropilparabena, pārnes uz 500 ml mērkolbu, izšķīdina un

uzpilda līdz zīmei ar etanola/ūdens maisījumu (atbilstoši šā

pielikuma 501.14.apakšpunktam).

501.16. Kustīgā fāze:

tetrahidrofurāna/ūdens/metanola/acetonitrila maisījums. Sajauc 5

tilpuma vienības tetrahidrofurāna, 60 tilpuma vienības ūdens, 10

tilpuma vienības metanola un 25 tilpuma vienības

acetonitrila.

501.17. Konservanta standartšķīdums: precīzi iesver aptuveni

0,2 g 2-fenoksietanola, 0,2 g 1-fenoksipropān-2-ola, 0,05 g

metilparabena, 0,05 g etilparabena, 0,05 g propilparabena, 0,05 g

butilparabena un 0,025 g benzilparabena 100 ml mērkolbā,

izšķīdina un uzpilda līdz atzīmei ar etanola/ūdens maisījumu.

Glabāts ledusskapī, šķīdums saglabājas stabils vienu nedēļu.

501.18. Konservantu standartšķīdumi: attiecīgi pārnes 20,00,

10,00, 5,00, 2,00 un 1,00 ml standartšķīduma (atbilstoši šā

pielikuma 501.17.apakšpunktam) uz 50 ml mērkolbām. Katrā kolbā

pievieno 10,00 ml iekšējā standarta šķīduma (atbilstoši šā

pielikuma 501.15.apakšpunktam) un 1,0 ml sērskābes šķīduma

(atbilstoši šā pielikuma 501.13.apakšpunktam) un uzpilda līdz

zīmei ar etanola/ūdens maisījumu. Šie šķīdumi būtu jāgatavo tieši

pirms lietošanas.

502. 2-Fenoksietanola, 1-fenoksipropān-2-ola, metil-, etil-,

propil-, butil- un benzil-4-hidroksibenzoāta noteikšanas metodei

izmanto laboratorijas standartaprīkojumu un šādu aprīkojumu:

502.1. Ūdens vanna, kurā var uzturēt 60±1 °C.

502.2. Augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfs ar 280 nm

ultraīsviļņu detektoru.

502.3. Hromatogrāfijas kolonna ar šādiem nosacījumiem:

502.3.1. Nerūsējošs tērauds.

502.3.2. Kolonnas garums 25 cm, iekšējais diametrs 4,6 mm (vai

attiecīgi 12,5 cm un 4,6 mm).

502.3.3. Nucleosil 5C18 vai līdzvērtīgs

pildījums.

502.4. Stikla mēģenes, 100 ml, ar skrūvējamu vāciņu.

502.5. Vārķermeņi, 2-4 mm karborunds vai līdzvērtīgi.

503. 2-Fenoksietanola, 1-fenoksipropān-2-ola, metil-, etil-,

propil-, butil- un benzil-4-hidroksibenzoāta noteikšanu veic šādā

kārtībā:

503.1. Parauga gatavošana:

503.1.1. Parauga gatavošana, nepievienojot iekšējo

standartu:

503.1.1.1. Iesver aptuveni 1,0 g parauga 100 ml stikla mēģenē

ar skrūvējamu vāciņu.

503.1.1.2. Ar pipeti mēģenē iepilina 1,0 ml sērskābes šķīduma

(atbilstoši šā pielikuma 501.13.apakšpunktam) un 50,0 ml

etanola/ūdens maisījuma (atbilstoši šā pielikuma

501.14.apakšpunktam).

503.1.1.3. Pievieno aptuveni 1 g vārķermeņu, noslēdz mēģeni un

spēcīgi krata, līdz rodas vienmērīga suspensija. Krata vismaz

vienu minūti.

503.1.1.4. Liek mēģeni uz piecām minūtēm ūdens vannā, kur

uztur 60±1 °C, lai paātrinātu konservantu ekstrakciju etanola

fāzē.

503.1.1.5. Tūlīt atdzesē mēģeni auksta ūdens strūklā un liek

ekstraktu ledusskapī uz vienu stundu.

503.1.1.6. Izfiltrē ekstraktu caur filtrpapīru.

503.1.1.7. Pārnes aptuveni 2 ml filtrāta uz 5 ml parauga

mēģeni.

503.1.1.8. Liek ekstraktus ledusskapī un 24 stundās veic

noteikšanu HPLC.

503.1.2. Parauga gatavošana, pievienojot iekšējo

standartu:

503.1.2.1. Iesver ar precizitāti līdz trim zīmēm aiz komata

1,0±0,1 g parauga 100 ml stikla mēģenē ar skrūvējamu vāciņu.

503.1.2.2. Ar pipeti mēģenē iepilina 1,0 ml sērskābes šķīduma

un 40,0 ml etanola/ūdens maisījuma.

503.1.2.3. Pievieno aptuveni 1 g vārķermeņu un precīzi 10,00

ml iekšējā standarta šķīduma.

503.1.2.4. Noslēdz mēģeni un spēcīgi krata, līdz iegūst

vienmērīgu suspensiju. Krata vismaz vienu minūti.

503.1.2.5. Liek mēģeni uz piecām minūtēm ūdens vannā, kur

uztur 60±1 °C, lai paātrinātu konservantu ekstrakciju etanola

fāzē.

503.1.2.6. Tūlīt atdzesē mēģeni auksta ūdens strūklā un liek

ekstraktu ledusskapī uz vienu stundu.

503.1.2.7. Izfiltrē ekstraktu caur filtrpapīru.

503.1.2.8. Pārnes aptuveni 2 ml filtrāta uz 5 ml parauga

mēģeni (parauga šķīdums).

503.1.2.9. Liek ekstraktu ledusskapī un 24 stundās veic

noteikšanu HPLC.

503.2. Augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfija

(HPLC):

503.2.1. Hromatogrāfijas apstākļi:

503.2.1.1. Kustīgā fāze:

tetrahidrofurāna/ūdens/metanola/acetonitrila maisījums

(atbilstoši šā pielikuma 501.16.apakšpunktam).

503.2.1.2. Plūsmas ātrums: 1,5 ml/minūtē.

503.2.1.3. Noteikšanas viļņa garums: 280 nm.

503.2.2. Kalibrēšana:

503.2.2.1. Ievada 10 µl katra konservanta standartšķīduma

(atbilstoši šā pielikuma 501.18.apakšpunktam).

503.2.2.2. Pēc iegūtajām hromatogrammām nosaka konservantu

standartšķīdumu pīķu augstumu attiecības pret iekšējā standarta

pīķa augstumu.

503.2.2.3. Konstruē katra konservanta līkni, attiecinot

minētās attiecības pret standartšķīdumu koncentrācijām.

503.2.3. Noteikšana:

503.2.3.1. Ievada 10 µl parauga šķīduma bez iekšējā standarta

(atbilstoši šā pielikuma 503.1.1.apakšpunktam) hromatogrāfā un

uzņem hromatogrammu.

503.2.3.2. Ievada 10 μl viena konservanta standarta šķīduma

(atbilstoši šā pielikuma 501.18.apakšpunktam) un uzņem

hromatogrammu.

503.2.3.3. Salīdzina iegūtās hromatogrammas: ja parauga

ekstrakta (atbilstoši šā pielikuma 503.1.1.4.apakšpunktam)

hromatogrammā nav neviena pīķa, kura izdalīšanas laiks ir

aptuveni vienāds ar izopropilparabena (ieteicamais iekšējais

standarts) pīķa izdalīšanas laiku, ievada 10 µl parauga šķīduma

ar iekšējo standartu (atbilstoši šā pielikuma

503.1.2.apakšpunktam). Uzņem hromatogrammu un izmēra pīķu

augstumus. Ja parauga šķīduma hromatogrammā ir traucējošs pīķis,

kura izdalīšanas laiks ir aptuveni vienāds ar izopropilparabena

pīķa izdalīšanas laiku, izvēlas citu iekšējo standartu. Ja kāds

analizējamais konservants neparādās parauga hromatogrammā, šo

konservantu var izmantot par alternatīvu iekšējo standartu.

503.2.3.4. Aprēķina analizējamo konservantu pīķu augstumu

attiecības pret iekšējā standarta pīķa augstumu.

503.2.3.5. Pārliecinās, vai kalibrēšanā izmantoto

standartšķīdumi veido taisnu līniju.

503.2.3.6. Pārliecinās, vai iegūtās standartšķīduma un parauga

šķīduma hromatogrammas atbilst šādiem nosacījumiem:

503.2.3.6.1. Vissliktāk atdalīto pīķu pāra atdalījums ir

vismaz 0,90 (pīķu atdalījums definēts šī pielikuma

12.attēlā).

Pīķu atdalījums (p)

p = f/g

12.attēls

Pīķu atdalījums

Ja nav panākts vajadzīgais atdalījums, būtu jālieto efektīvāka

kolonna vai jāregulē mobilās fāzes sastāvs,

līdz panāk vajadzīgo atdalījumu

503.2.3.6.2. Asimetrijas faktors: visi iegūtie pīķi ir 0,9-1,5

(pīķu asimetrijas faktors definēts šī pielikuma 13.attēlā). Lai

uzņemtu hromatogrammu asimetrijas faktora noteikšanai, ieteicams

pašrakstītāja ātrums vismaz 2 cm minūtē.

Asimetrijas faktors (As)

As = b/a

13.attēls

Pīķu asimetrijas faktors

503.2.3.6.3. Iegūst vienmērīgu bāzes līniju.