500. pants

Paraugu paskābina, pievienojot sērskābi, un pēc tam suspendē etanola un ūdens maisījumā. Maisījumu viegli karsē, lai izkausētu lipīdu fāzi un veicinātu kvantitatīvu ekstrakciju, pēc tam maisījumu izfiltrē. Konservantus filtrātā nosaka apgrieztas fāzes HPLC, par iekšējo standartu izmantojot izopropil-4-hidroksibenzoātu.

501. 2-Fenoksietanola, 1-fenoksipropān-2-ola, metil-, etil-, propil-, butil- un benzil-4-hidroksibenzoāta noteikšanas metodei izmanto šādus reaģentus1, 2, 3:

501.1. Absolūtais etanols.

501.2. 2-fenoksietanols.

501.3. 1-fenoksipropān-2-ols.

501.4. Metil-4-hidroksibenzoāts (metilparabens).

501.5. Etil-4-hidroksibenzoāts (etilparabens).

501.6. n-propil-4-hidroksibenzoāts (propilparabens).

501.7. Izopropil-4-hidroksibenzoāts (izopropilparabens).

501.8. n-butil-4-hidroksibenzoāts (butilparabens).

501.9. Benzil-4-hidroksibenzoāts (benzilparabens).

501.10. Tetrahidrofurāns.

501.11. Metanols.

501.12. Acetonitrils.

501.13. Sērskābes šķīdums, c(H2SO4) = 2 mol/l.

501.14. Etanola/ūdens maisījums: sajauc deviņas tilpuma vienības etanola un vienu tilpuma vienību ūdens.

501.15. Iekšējā standarta šķīdums: precīzi nosver aptuveni 0,25 g izopropilparabena, pārnes uz 500 ml mērkolbu, izšķīdina un uzpilda līdz zīmei ar etanola/ūdens maisījumu (atbilstoši šā pielikuma 501.14.apakšpunktam).

501.16. Kustīgā fāze: tetrahidrofurāna/ūdens/metanola/acetonitrila maisījums. Sajauc 5 tilpuma vienības tetrahidrofurāna, 60 tilpuma vienības ūdens, 10 tilpuma vienības metanola un 25 tilpuma vienības acetonitrila.

501.17. Konservanta standartšķīdums: precīzi iesver aptuveni 0,2 g 2-fenoksietanola, 0,2 g 1-fenoksipropān-2-ola, 0,05 g metilparabena, 0,05 g etilparabena, 0,05 g propilparabena, 0,05 g butilparabena un 0,025 g benzilparabena 100 ml mērkolbā, izšķīdina un uzpilda līdz atzīmei ar etanola/ūdens maisījumu. Glabāts ledusskapī, šķīdums saglabājas stabils vienu nedēļu.

501.18. Konservantu standartšķīdumi: attiecīgi pārnes 20,00, 10,00, 5,00, 2,00 un 1,00 ml standartšķīduma (atbilstoši šā pielikuma 501.17.apakšpunktam) uz 50 ml mērkolbām. Katrā kolbā pievieno 10,00 ml iekšējā standarta šķīduma (atbilstoši šā pielikuma 501.15.apakšpunktam) un 1,0 ml sērskābes šķīduma (atbilstoši šā pielikuma 501.13.apakšpunktam) un uzpilda līdz zīmei ar etanola/ūdens maisījumu. Šie šķīdumi būtu jāgatavo tieši pirms lietošanas.

502. 2-Fenoksietanola, 1-fenoksipropān-2-ola, metil-, etil-, propil-, butil- un benzil-4-hidroksibenzoāta noteikšanas metodei izmanto laboratorijas standartaprīkojumu un šādu aprīkojumu:

502.1. Ūdens vanna, kurā var uzturēt 60±1 °C.

502.2. Augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfs ar 280 nm ultraīsviļņu detektoru.

502.3. Hromatogrāfijas kolonna ar šādiem nosacījumiem:

502.3.1. Nerūsējošs tērauds.

502.3.2. Kolonnas garums 25 cm, iekšējais diametrs 4,6 mm (vai attiecīgi 12,5 cm un 4,6 mm).

502.3.3. Nucleosil 5C18 vai līdzvērtīgs pildījums.

502.4. Stikla mēģenes, 100 ml, ar skrūvējamu vāciņu.

502.5. Vārķermeņi, 2 4 mm karborunds vai līdzvērtīgi.

503. 2-Fenoksietanola, 1-fenoksipropān-2-ola, metil-, etil-, propil-, butil- un benzil-4-hidroksibenzoāta noteikšanu veic šādā kārtībā:

503.1. Parauga gatavošana:

503.1.1. Parauga gatavošana, nepievienojot iekšējo standartu:

503.1.1.1. Iesver aptuveni 1,0 g parauga 100 ml stikla mēģenē ar skrūvējamu vāciņu.

503.1.1.2. Ar pipeti mēģenē iepilina 1,0 ml sērskābes šķīduma (atbilstoši šā pielikuma 501.13.apakšpunktam) un 50,0 ml etanola/ūdens maisījuma (atbilstoši šā pielikuma 501.14.apakšpunktam).

503.1.1.3. Pievieno aptuveni 1 g vārķermeņu, noslēdz mēģeni un spēcīgi krata, līdz rodas vienmērīga suspensija. Krata vismaz vienu minūti.

503.1.1.4. Liek mēģeni uz piecām minūtēm ūdens vannā, kur uztur 60±1 °C, lai paātrinātu konservantu ekstrakciju etanola fāzē.

503.1.1.5. Tūlīt atdzesē mēģeni auksta ūdens strūklā un liek ekstraktu ledusskapī uz vienu stundu.

503.1.1.6. Izfiltrē ekstraktu caur filtrpapīru.

503.1.1.7. Pārnes aptuveni 2 ml filtrāta uz 5 ml parauga mēģeni.

503.1.1.8. Liek ekstraktus ledusskapī un 24 stundās veic noteikšanu HPLC.

503.1.2. Parauga gatavošana, pievienojot iekšējo standartu:

503.1.2.1. Iesver ar precizitāti līdz trim zīmēm aiz komata 1,0±0,1 g parauga 100 ml stikla mēģenē ar skrūvējamu vāciņu.

503.1.2.2. Ar pipeti mēģenē iepilina 1,0 ml sērskābes šķīduma un 40,0 ml etanola/ūdens maisījuma.

503.1.2.3. Pievieno aptuveni 1 g vārķermeņu un precīzi 10,00 ml iekšējā standarta šķīduma.

503.1.2.4. Noslēdz mēģeni un spēcīgi krata, līdz iegūst vienmērīgu suspensiju. Krata vismaz vienu minūti.

503.1.2.5. Liek mēģeni uz piecām minūtēm ūdens vannā, kur uztur 60±1 °C, lai paātrinātu konservantu ekstrakciju etanola fāzē.

503.1.2.6. Tūlīt atdzesē mēģeni auksta ūdens strūklā un liek ekstraktu ledusskapī uz vienu stundu.

503.1.2.7. Izfiltrē ekstraktu caur filtrpapīru.

503.1.2.8. Pārnes aptuveni 2 ml filtrāta uz 5 ml parauga mēģeni (parauga šķīdums).

503.1.2.9. Liek ekstraktu ledusskapī un 24 stundās veic noteikšanu HPLC.

503.2. Augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfija (HPLC):

503.2.1. Hromatogrāfijas apstākļi:

503.2.1.1. Kustīgā fāze: tetrahidrofurāna/ūdens/metanola/acetonitrila maisījums (atbilstoši šā pielikuma 501.16.apakšpunktam).

503.2.1.2. Plūsmas ātrums: 1,5 ml/minūtē.

503.2.1.3. Noteikšanas viļņa garums: 280 nm.

503.2.2. Kalibrēšana:

503.2.2.1. Ievada 10 µl katra konservanta standartšķīduma (atbilstoši šā pielikuma 501.18.apakšpunktam).

503.2.2.2. Pēc iegūtajām hromatogrammām nosaka konservantu standartšķīdumu pīķu augstumu attiecības pret iekšējā standarta pīķa augstumu.

503.2.2.3. Konstruē katra konservanta līkni, attiecinot minētās attiecības pret standartšķīdumu koncentrācijām.

503.2.3. Noteikšana:

503.2.3.1. Ievada 10 µl parauga šķīduma bez iekšējā standarta (atbilstoši šā pielikuma 503.1.1.apakšpunktam) hromatogrāfā un uzņem hromatogrammu.

503.2.3.2. Ievada 10 μl viena konservanta standarta šķīduma (atbilstoši šā pielikuma 501.18.apakšpunktam) un uzņem hromatogrammu.

503.2.3.3. Salīdzina iegūtās hromatogrammas: ja parauga ekstrakta (atbilstoši šā pielikuma 503.1.1.4.apakšpunktam) hromatogrammā nav neviena pīķa, kura izdalīšanas laiks ir aptuveni vienāds ar izopropilparabena (ieteicamais iekšējais standarts) pīķa izdalīšanas laiku, ievada 10 µl parauga šķīduma ar iekšējo standartu (atbilstoši šā pielikuma 503.1.2.apakšpunktam). Uzņem hromatogrammu un izmēra pīķu augstumus. Ja parauga šķīduma hromatogrammā ir traucējošs pīķis, kura izdalīšanas laiks ir aptuveni vienāds ar izopropilparabena pīķa izdalīšanas laiku, izvēlas citu iekšējo standartu. Ja kāds analizējamais konservants neparādās parauga hromatogrammā, šo konservantu var izmantot par alternatīvu iekšējo standartu.

503.2.3.4. Aprēķina analizējamo konservantu pīķu augstumu attiecības pret iekšējā standarta pīķa augstumu.

503.2.3.5. Pārliecinās, vai kalibrēšanā izmantoto standartšķīdumi veido taisnu līniju.

503.2.3.6. Pārliecinās, vai iegūtās standartšķīduma un parauga šķīduma hromatogrammas atbilst šādiem nosacījumiem:

503.2.3.6.1. Vissliktāk atdalīto pīķu pāra atdalījums ir vismaz 0,90 (pīķu atdalījums definēts šī pielikuma 12.attēlā).

Pīķu atdalījums (p)

p = f/g

12.attēls

Pīķu atdalījums

Ja nav panākts vajadzīgais atdalījums, būtu jālieto efektīvāka kolonna vai jāregulē mobilās fāzes sastāvs,

līdz panāk vajadzīgo atdalījumu

503.2.3.6.2. Asimetrijas faktors: visi iegūtie pīķi ir 0,9 1,5 (pīķu asimetrijas faktors definēts šī pielikuma 13.attēlā). Lai uzņemtu hromatogrammu asimetrijas faktora noteikšanai, ieteicams pašrakstītāja ātrums vismaz 2 cm minūtē.

Asimetrijas faktors (As)

As = b/a

13.attēls

Pīķu asimetrijas faktors

503.2.3.6.3. Iegūst vienmērīgu bāzes līniju.