6. pants

Vīrusa identificēšana

Ja novērojumi liecina, ka šūnu kultūrā ir CPE, ievāc barotni (centrifugātu) un pārbauda ar vienu vai vairākiem šādiem paņēmieniem: imūnfermentatīvā analīze (ELISA), imūnfluorescence (IF), neitralizācija, RT-PCR vai RT-qPCR. Ja ar šiem testiem vienas nedēļas laikā vīrusu nav bijis iespējams galīgi identificēt, centrifugāt nekavējošai identifikācijai nosūta uz citu Eiropas Savienības references laboratoriju.

6.1. ELISA

Vīrusa izolāta identificēšanai izdara divslāņu ELISA ar divām antivielām. Mikrotitrēšanas platēs uzklāj pārklājumu, daudzumā 50 μl uz iedobi (0,9 pg) iepilinot no truša antiseruma pret virālās hemorāģiskās septicēmijas vīrusu vai infekciozās hematopoētiskās nekrozes vīrusu iegūtu pierādītas kvalitātes attīrītu A proteīna imūnglobulīnu (Ig) karbonāta buferšķīdumā (pH 9,6) ar nātrija azīda saturu 15 mM, un no 18 stundām līdz 2 nedēļām inkubē 4 °C temperatūrā.

Šķīdumu platē katru paraugu, kas satur 1 % Triton X-100, un pozitīvos kontrolparaugus atšķaida ar buferšķīdumu (liellopu seruma albumīnu fosfātu fizioloģiskajā buferšķīdumā PBS-T, BSA 1 %) četros atšķaidījumos: neatšķaidīts, 1:4, 1:16, 1:64. ELISA plates skalo fosfātu fizioloģiskajā buferšķīdumā, kas satur 0,05 % Tween-20 (PBS-T), un noskalotajā un ar pārklājumu klātajā ELISA platē ievada 50 µl no katras šķīdumu plates šķīdumu koncentrācijas.

Pēc tam ELISA plates 30 minūtes inkubē 37 °C temperatūrā. Tad plates skalo un 30 minūtes 37 °C temperatūrā inkubē ar specifiskām monoklonālajām antivielām (konkrētāk, virālās hemorāģiskās septicēmijas vīrusa identificēšanai ar MAb IP5B11 un infekciozās hematopoētiskās nekrozes vīrusa identificēšanai attiecīgi ar Hyb 136-3). ELISA platē pievieno 50 µl truša pretpeles antivielas mārrutku peroksidāzes konjugāta atšķaidījumā ar PBS-T-BSA 1:1000.

Pēc atkārtotas skalošanas ierosina reakcijas, katrā iedobē pievienojot 50 μl ortofenilēndiamīna (OPD). ELISA plates tumsā istabas temperatūrā inkubē 20 minūtes, un reakciju apstādina, katrā iedobē pievienojot 100 μl 0,5 M H2SO4.

ELISA lasāmierīcē monitorē absorbenci viļņa garumiem 492 un 620 nm. Pēc testa rezultātu salīdzināšanas ar pozitīvo un negatīvo kontroļu absorbences vērtībām paraugus apzīmē kā pozitīvus vai negatīvus. Kopumā paraugus, kam neatšķaidītam materiālam kopējā absorbence (A) < 0,5, uzskata par negatīviem, paraugus ar A vērtībām no 0,5 līdz 1,0 uzskata par aizdomīgiem un paraugus, kam A > 1,0, uzskata par pozitīviem.

Šajā punktā minēto ELISA variantu vietā var izmantot citus ar pierādītu līdzvērtīgu rezultativitāti.

6.2. Imūnfluorescence - IF

Virālās hemorāģiskās septicēmijas un infekciozās hematopoētiskās nekrozes vīrusus identificē:

- inficējot šūnas 96 iedobju "Black" platēs;

- inficējot šūnas parastajās 24 iedobju platēs vai uz 24 iedobju plates segstikliem.

Ja virālās hemorāģiskās septicēmijas vai infekciozās hematopoētiskās nekrozes vīrusus vai tos abus identificē, inficējot šūnas uz segstikliem, rīkojas pēc šāda protokola:

(a) segstikliem uzsēj šūnas tādā blīvumā, lai pēc 24 stundu kultivēšanas būtu 60 % līdz 90 % konfluence. Ja iespējams, šajā nolūkā ieteicamas EPC šūnas, jo tās stingri pielīp stikla virsmām, tomēr tikpat labi var izmantot citas šūnu līnijas - tādas kā BF-2, RTG-2 vai FHM. 150 μl šūnu kultūras centrifugāta divos dažādos atšķaidījumos (1:10 un 1:1000) dublikātā inokulē vienu dienu vecos monoslāņos un 24 stundas inkubē 15 °C temperatūrā;

(b) pēc tam barotni ar šūnu kultūru izņem un inficētos šūnu monoslāņus fiksē ar 0,5 ml ledusauksta acetona ūdens šķīduma (80 % tilpumkoncentrācija). Fiksāciju 15 minūtes istabas temperatūrā veic velkmes skapī, pēc tam no acetona šķīduma atbrīvojas un segstikliņus vismaz 30 minūtes žāvē ar gaisu. Šajā posmā plates vai nu nekavējoties apstrādā, vai - 20 °C temperatūrā glabā turpmākai lietošanai;

(c) specifiskas monoklonālas antivielas (konkrētāk, virālās hemorāģiskās septicēmijas vīrusa identificēšanai MAb IP5B11, savukārt infekciozās hematopoētiskās nekrozes vīrusa identificēšanai attiecīgi Hyb 136-3) atšķaida 0,01 M PBST ar pH 7,2 tādā atšķaidījumā, kā ieteic MAb piegādātājs; fiksētajam monoslānim pievieno 50 līdz 100 μl uz iedobi, un plates mitrā kamerā vienu stundu inkubē 37 °C temperatūrā;

(d) segstikliņus trīs reizes saudzīgi skalo ar 0,05 % Tween-20 saturošu fosfātu buferšķīdumu (PBS-T) un pēc pēdējās skalošanas no visa buferšķīduma atbrīvojas. Pēc tam šūnas vienu stundu inkubē 37 °C, par primāro antivielu lietojot peļu imūnglobulīna antivielu konjugātu fluorescīna izotiocianātā (FITC) vai tetrametilrodamīna-5-(un-6-) izotiocianātā (TRITC), saskaņā ar piegādātāja norādījumiem atšķaida, atkal skalo PBS-T un nožāvē. Iekrāsotās kultūras novieto uz priekšmetstikliņiem, izmantojot glicerīna sālsūdens šķīdumu, un pārbauda krītošā ultravioletā (UV) gaismā. Izmanto 10x un 12x okulārus un 25x vai 40x objektīva lupu ar skaitlisko apertūru attiecīgi < 0,7 un < 1,3.

Alternatīvi attiecībā uz šūnu kultūrām, fiksēšanu un standartkvalitātes antivielām var lietot citus IF paņēmienus ar pierādītu līdzvērtīgu rezultativitāti.

6.3. Neitralizācija

No ievāktā centrifugāta, centrifugējot (2000 līdz 4000 x apgriezieniem/minūtē) vai filtrējot caur membrānas filtru (0,45 μm) ar zemu olbaltumvielu saistīšanas spēju, atdala šūnas, un centrifugātu barotnē ar šūnu kultūru atšķaida 1:100 un 1:10000.

Vismaz divu centrifugāta atšķaidījumu alikvotas atsevišķi sajauc ar vienādām turpmāk minēto reaģentu daļām un pēc tam 60 minūtes inkubē 15 °C temperatūrā:

a) serums, kas satur specifiskas grupas antivielas pret virālās hemorāģiskās septicēmijas vīrusu atšķaidījumā 1:50 (tilpumkoncentrācija);

b) serums, kas satur specifiskas grupas antivielas pret infekciozās hematopoētiskās nekrozes vīrusu atšķaidījumā 1:50 (tilpumkoncentrācija);

c) kopots antiserums pret vietējiem infekciozās pankreātiskās nekrozes vīrusa serotipiem atšķaidījumā 1:50 (tilpumkoncentrācija);

d) tikai barotne (pozitīvais kontrolparaugs).

Katram vīrusa centrifugāta un seruma maisījumam inokulē vismaz divas šūnu kultūras, katru ar 50 μl, un pēc tam inkubē 15 °C temperatūrā. Ņemot vērā šīs nodaļas 5.4. apakšpunktā noteiktos raksturlielumus, pārliecinās, vai nerodas CPE.

Virālās hemorāģiskās septicēmijas vīrusu celmus un izolātus, kas nereaģē neitralizācijas testos, identificē ar IF vai ar ELISA.

Alternatīvi var izmantot citus neitralizācijas testus ar pierādītu līdzvērtīgu rezultativitāti.

6.4. RT-PCR/RT-qPCR

6.4.1. Vīrusu RNS sagatavošana

Visas darbības ar RNS veic cimdos uz ledus.

Ribonukleīnskābes ekstrahē ar fenola hloroforma metodi vai ar ribonukleīnskābes afinitātes rotācijas stobriņiem saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Drīkst izmantot tirdzniecībā pieejamos RNS ekstrahēšanas komplektus, ar kuriem iegūstama augsti kvalitatīva RNS, kas piemērota izmantošanai turpmāk aprakstītajos RT-PCR protokolos.

Ribonukleīnskabes atkārtoti suspendē destilētā no ribonukleāzes brīvā ūdenī (proti, ar 0,1 % dietilpirokarbonātu apstrādātā ūdenī) vai piemērotā eluēšanas buferšķīdumā.

6.4.2. RT-PCR

Infekciozās hematopoētiskās nekrozes vīrusa konstatēšanai izmanto šādus praimerus:

tiešais praimeris: 5'-AGA-GAT-CCC-TAC-ACC-AGA-GAC-3';

atgriezeniskais praimeris: 5'-GGT-GGT-GTT-GTT-TCC-GTG-CAA-3'.

Izmanto šādus ciklus (viensoļa RT-PCR): 1 cikls: 50 °C 30 min; 1 cikls: 95 °C 2 min; 30 cikli: 95 °C 30 sekundes, 50 °C 30 sekundes, 72 °C 60 sekundes; 1 cikls: 72 °C 7 min un mērcēšana 4 °C temperatūrā.

Virālās hemorāģiskās septicēmijas vīrusa konstatēšanai izmanto šādus praimerus:

VN tiešais: 5'-ATG-GAA-GGA-GGA-ATT-CGT-GAA-GCG-3';

VN atgriezeniskais: 5'-GCG-GTG-AAG-TGC-TGC-AGT-TCC-C-3'.

Izmanto šādus ciklus (viensoļa RT-PCR): 50 °C 30 min, 95 °C 15 min, 35 cikli ar 94 °C 30 sekundes, 55 °C 30 sekundes, 68 °C 60 sekundes. Pēc tam 68 °C temperatūrā 7 minūtes ļauj notikt reakcijai.

RT-PCR reakciju daudzumu un specifiskumu izvērtē ar gela elektroforēzi 1,5 % agarozes gelā ar etīdija bromīdu un novēro ultravioletajā caurgaismošanā. Attiecībā uz infekciozās hematopoētiskās nekrozes vīrusu var novērot PCR amplikonu 693 bp. Attiecībā uz virālās hemorāģiskās septicēmijas vīrusu šis lielums ir 505 bp.

PCR rezultāti var variēt atkarībā no tās izpildīšanas apstākļiem, proti, atkarībā no izmantotā dezoksiribonukleīnskābes (turpmāk DNS) amplifikatora var būt nepieciešams optimizēt amplificēšanas protokolus. Nepareizas praimeru hibridizācijas vai laboratoriskas kontaminācijas dēļ var tikt iegūti viltus pozitīvi rezultāti. Tāpēc, lai novērstu jebkādas šaubas, ir jāiekļauj pietiekami pozitīvie un negatīvie kontrolparaugi un sekvenēšanas amplikoni. Attiecībā uz virālās hemorāģiskās septicēmijas vīrusa praimeriem īpaši uzmanīgi jārīkojas ar BF-2 šūnām, jo praimeri var reaģēt ar šūnu līnijas DNS/RNS, dodot līdzīga izmēra viltuspozitīvu rezultātu. Testējot no BF-2 šūnām iegūtu centrifugātu, visi amplificētie PCR fragmenti jāsekvenē.

6.4.3. RT-qPCR virālās hemorāģiskās septicēmijas vīrusa noteikšanai

Virālās hemorāģiskās septicēmijas vīrusa noteikšanai amplificēšanu veic ar šādiem praimeriem un provi:

tiešais praimeris: 5'-AAA-CTC-GCA-GGA-TGT-GTG-CGT-CC-3',

atgriezeniskais praimeris: 5'-TCT-GCG-ATC-TCA-GTC-AGG-ATG-AA-3'

un prove: 5'-FAM-TAG-AGG-GCC-TTG-GTG-ATC-TTC-TG-BHQ1.

Viensoļa RT-PCR

Katrā plašu atkārtojumā iekļauj negatīvus veidnes kontrolparaugus un pozitīvus kontrolparaugus. Ciklēšanas nosacījumi: 50 °C 30 min, 95 °C 15 min, 40 cikli ar 94 °C 15 s, 60 °C 40 s, 72 °C 20 s; ja nepieciešams, koriģē. Aprakstītā varianta vietā var izmantot citus RT-PCR vai RT-qPCR variantus ar pierādītu līdzvērtīgu rezultativitāti.

6.4.4. RT-qPCR IHNV noteikšanai

Infekciozās hematopoētiskās nekrozes vīrusa noteikšanai amplificēšanu veic ar šādiem praimeriem un provi:

tiešais praimeris: 5'- AGA-GCC-AAG-GCA-CTG-TGC-G-3',

atgriezeniskais praimeris: 5'- TTCTTTGCGGCTTGGTTGA 3'

un prove: 5' 6FAM-TGAGACTGAGCGGGACA-NFQ/MGB.

Divsoļu RT-qPCR

Turpmāk minētais tests ir atkarīgs no divsoļu amplifikācijas. Lai nenotiktu kontaminēšanās, ar abu reakciju mēģenēm rīkojas ļoti piesardzīgi.

Ciklēšanas nosacījumi (pēc RT soļa): 50 °C 2 min, 95 °C 10 min, 40 cikli ar 95 °C 15 sekundes un 60 °C 1 min. (ja nepieciešams, koriģē).

Aprakstītā varianta vietā var izmantot citus RT-PCR vai RT-qPCR variantus ar pierādītu līdzvērtīgu rezultativitāti.